使用中空纤维膜反应器进行蛋白质连续高选择性单PEG修饰
简介
PEG修饰通过将聚乙二醇（PEG）偶联到蛋白质，从而增加蛋白药物的治疗效力，其作用主要体现在：1. 通过增加水力学尺寸，延长体内半衰期；2. 降低给药频率，提高患者舒适性；3. 以无免疫原性PEG“遮蔽”抗原位点，降低药物免疫原性；4. 亲水性PEG成分稳定PEG修饰蛋白，降低蛋白质聚集。目前已有数种治疗性PEG修饰蛋白药物获得FDA批准。
PEG修饰过程通常使用均相反应器批处理进行，常规的偶联模式是将PEG偶联到蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基基团上，但一个蛋白质中一般有多个ε-氨基基团，且由于反应物、产物及副产物的共存，反应液中会混合存在多种不同程度PEG修饰的蛋白质，包括单、双、三及多PEG修饰蛋白质及其同分异构体。从稳定治疗活性及产物精确鉴定方面来讲，需要的产物为特定位点单个PEG分子修饰的蛋白质，而由于不同PEG修饰蛋白的理化性质十分相似，所以从混合液中纯化单PEG修饰蛋白相当困难。随着对新型PEG修饰蛋白药物质量要求的严格化，蛋白质PEG修饰过程的选择性要求日益提高。
对于提高PEG修饰过程选择性的关注大多集中于位点特异性的新反应技术，包括N-端PEG修饰、半胱氨酸PEG修饰、组氨酸亲和标签及谷氨酸的PEG修饰等，但这些方法都无法避免多PEG修饰蛋白的形成。另一类方法是通过“物理”途径来提高PEG修饰过程的选择性，包括体积排阻反应色谱及固相（“在柱”）PEG修饰，前者将反应物以不同的脉冲注入色谱柱，各反应物及产物因尺寸差异而被“隔开”，且以不同时间洗脱；后者将反应物先后注入固定床，先注入反应物固定在吸附物上，再与后注入反应物反应，然后以特定洗脱方式获得高纯度产物，两种方法均可提高反应的选择性，但都局限于小规模的批量处理，不适于规模放大和工业化生产。
本文旨在介绍一种提高蛋白质单PEG修饰选择性和程度的新技术，其原理可解释如下：多数PEG试剂都是“单功能性”的，即一个PEG分子只能偶联到一个蛋白质分子，而一个蛋白质分子具有多个结合位点，从而偶联多个PEG。所以，当反应混合物中的PEG含量高于蛋白质含量时，虽然蛋白质的PEG修饰程度会提高，但多PEG修饰蛋白副产物的合成也会提高；而当蛋白质过量时，单PEG修饰的选择性会提高（选择性定义为转化为单PEG修饰蛋白质在所有形式PEG修饰蛋白质中的比例），但蛋白质修饰转化率降低（转化率定义为转化为任一PEG修饰形式的蛋白质的量），即造成蛋白质浪费。在传统批量反应中，如采用补料分批模式，该情况可有所缓解；但本实验决定测试一种新型的管状反应器，即蛋白质在管状通道内流动，而PEG轴向分散添加（图1）。如果限制PEG的添加量，且保证蛋白质过量，则可有效提高单PEG修饰蛋白合成的选择性，并抑制多PEG修饰形式的合成，此外，蛋白质和PEG的添加模式会在管道内形成径向物质浓度梯度，进一步提高选择性。与传统等量液相批量反应模式相比，该模式的单PEG修饰选择性和程度均可显著提升。
图1. 在管状反应器内，通过在蛋白质溶液轴线分散添加PEG试剂，以增加单PEG修饰选择性的模式图。
基于以上理论，实验使用中空纤维膜反应器（HMR），其原理如图2所示。蛋白质溶液从一端泵入纤维内腔，PEG试剂注入壳腔（纤维外腔），沿纤维散状分布。PEG修饰蛋白合成后，与未反应蛋白和PEG一起，从出口流出。实验模式蛋白为溶菌酶（MW 14,100； pI 11），PEG为甲氧基-PEG-（CH2）5COO-NHS（5kD PEG等量）。偶联过程基于酰化作用形成酰胺键，即蛋白质置换NHS基团。
图
2. 使用中空纤维膜反应器进行蛋白质PEG修饰的模式图。
2. 使用中空纤维膜反应器进行蛋白质PEG修饰的模式图。
实验
HMR使用MicroKros中空纤维膜组件，产品编号X15S-300-04N，聚砜材质，MWCO 50kD，纤维数量6根，纤维长度20cm，纤维内径0.5mm，有效膜表面积20cm2。膜MWCO选择50kD，可允许5kD的PEG自由通过。所有PEG修饰反应在室温下进行，反应pH为8.0。
图3. 中空纤维膜反应器实验设置：1）PEG试剂容器，2）泵，3）流量计，4）压力传感器，5）蛋白质容器，6）泵，7）流量计，8）压力传感器，9）中空纤维组件，10）UV检测器，11）样品采集器。
实验使用了批次液相PEG修饰反应作为对照，并测试了不同PEG：溶菌酶摩尔比对反应结果的影响。使用HMR系统进行溶菌酶PEG修饰的过程采用连续模式进行（图3），同时打开两个泵，将蛋白质和PEG试剂以恒定流速分别泵入纤维内腔和壳腔，起始反应，产物从出口流出，经UV检测器后，收集样品并经SDS-PAGE分析。
讨论
批量液相PEG修饰反应通常使用过量的PEG试剂，以提高蛋白质PEG修饰程度，但往往导致副产物合成增加；而当蛋白质过量时，虽然单PEG合成的选择性提高了，修饰转化率却显著降低。结果显示，在批量液相模式中（PEG：蛋白质摩尔比为4），单PEG修饰蛋白质合成较快（15min以内转化率0.364，选择性0.583），但随反应时间延长，多PEG修饰蛋白质逐渐形成，单PEG修饰蛋白转化率和选择性均下降。而如提高蛋白质含量，单PEG修饰蛋白质合成选择性提高，但转化率显著下降；如提高PEG含量，则转化率提高，选择性下降，增加后期纯化难度。
图4. 批量液相反应法制备产物SDS-PAGE图，PEG：溶菌酶摩尔比为4，可见单PEG修饰的选择性较低。
实验测试了HMR模式的不同操作条件，如不同PEG：蛋白质摩尔比、反应（滞留）时间等。在均质液相批量反应器中，反应器内不同部位的反应物及产物浓度不会有显著差异，而在HMR中，由于设备构造（管状）和操作模式（分散添加）的原因，会形成反应物/产物浓度梯度，所以反应器内溶菌酶的浓度应表示为总表观表观浓度（Capp）：
图5. 中空纤维膜反应器法制备产物SDS-PAGE图，Rapp为0.65，τlm为13.7min，可见单PEG修饰选择性较高。
实验结果说明，PEG试剂沿中空纤维膜分散添加了单PEG修饰的程度和选择性。溶菌酶、PEG试剂及PEG修饰溶菌酶在单根中空纤维内的分布如图6所示，中空纤维内反应物和产物的轴向和径向浓度梯度均有利于提高单PEG修饰的程度和选择性。由于PEG穿过膜进入膜内腔，其在纤维内壁边缘流动区域的浓度最高；而溶菌酶在中轴线附近浓度最高，膜内腔液流以“层流”模式流动，故反应物与产物的传输主要以扩散方式进行，溶菌酶径向向外扩散，PEG轴向向内扩散，两者在某位点相遇并反应，单PEG修饰蛋白质合成后再从该区域向两个方向扩散。但如上所述，由于流动模式为层流，反应区与中轴线之间的液体流速高于反应区与纤维壁之间的流速，所以单PEG修饰蛋白更多地倾向于“向内”扩散流动，该过程将单PEG修饰蛋白带离反应区，从而提高反应的选择性，进而提高转化率。
图6. HMR系统内反应物与产物的轴向及径向浓度梯度分布。
由讨论可知，使用HMR进行蛋白质PEG修饰相比批次反应釜处理，具有明显优势，不仅单PEG修饰的选择性和程度明显提高，还可以连续模式进行操作，且规模放大更简单，即更适于工业化生产。HMR系统也可用于其他需要控制选择性的化学偶联反应。
文献来源：
Shang X., Ghosh, R., Membrane reactor for continuous and selective protein mono-PEGylation. Journal of Membrane Science, 2014, 451:177-184.
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