磷酸果糖激酶测定试剂盒 微量法-酶-试剂-生物在线
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磷酸果糖激酶测定试剂盒  微量法

磷酸果糖激酶测定试剂盒 微量法

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产品名称: 磷酸果糖激酶测定试剂盒 微量法

英文名称: Micro Phosphofructokinase (PFK) Assay Kit

产品编号: BC0535

产品价格: 0

产品产地: 北京市通州区马驹桥联东U谷85A三

品牌商标: Solarbio

更新时间: 2024-12-24T09:36:47

使用范围: null

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产品内容:

提取液:液体100mL×1瓶,4保存;

试剂一:液体20mL×1瓶,4保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20保存

试剂三:液体×1支,-20保存

试剂四:液体×1支,4保存

产品说明:

    PFKEC 2.7.1.11广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。

    PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PFK活性。

需自备的仪器和用品

    紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本的前处理

1、 细菌或培养细胞:

先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个)提取液体积(mL)为500-10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或者200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2、 组织:

    按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

3、 血清(浆)样品:直接检测。

二、测定步骤和加样表

1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2. 样本测定

1)在试剂二瓶中加入17mL试剂一和1.13mL蒸馏水充分溶解,置于37(哺乳动物)或25(其他物种)水浴5分钟。用不完的试剂4保存一周。

2)在试剂三中加入1mL蒸馏水充分混匀,冰上放置备用;用不完的试剂4保存一周。

3)在试剂四中加入1mL蒸馏水充分混匀,冰上放置待用;用不完的试剂4保存一周。

4)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四和170μL试剂二,混匀,立即记录340nm20s时的吸光值A1比色后迅速将比色皿96孔板连同反应液一起放入37(哺乳动物)或25(其它物种)水浴或恒温箱中,准确反应10分钟;迅速取出比色皿并擦干,340 nm下比色,记录1020秒时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2

注意

1、比色皿中反应液的温度必须保持3725,取小烧杯一只装入一定量的3725蒸馏水,将此烧杯放入3725水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

2、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

3不同匀浆组织中PFK活力不一样,做正式试验之前请坐1-2个预实验,若ΔA>0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min5min,使ΔA<0.5,以提高检测的灵敏度。

三、PFK活力单位的计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、血清(浆)PFK活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/mL=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷V÷T=321×△A

2、组织、细菌或细胞中PFK活力的计算:

(1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/mg prot)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(Cpr×V)÷T=321×△A ÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/g 鲜重)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(W×V÷V样总)÷T=321×△A ÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/104 cell)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(500×V÷V样总)÷T=0.642×△A

V反总:反应体系总体积,2×10-4LεNADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cmd:比色皿光径,1 cmV样:加入样本体积,0.01mLV样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,10minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

 

 

b.用96孔板测定的计算公式如下:

1、血清(浆)PFK活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/mL=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷V÷T=535×△A

2、组织、细菌或细胞中PFK活力的计算:

(4) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/mg prot)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(Cpr×V)÷T=535×△A ÷Cpr

(5) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFKU/g 鲜重)=[△A×V反总÷ε×d×109] ÷(W×V÷V样总)÷T=535×△A ÷W

(6) 按细菌或细胞密度