冻干LAMP HNB变色扩增试剂盒

描述：Bst DNA 聚合酶是 Bacillus stearothermophilus DNA 聚合酶的一部分，具有很强的链置换活性，以及 5’→3’的 DNA 聚合酶活性，因此可以应用于 LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)检测实验。该制品内含 Bst4.0 DNA 聚合酶因此既可以扩增 DNA，也可以直接扩增 RNA 分子。 LAMP 是一种新型核酸扩增技术。采用 4 或 6 条能够识 别目的基因上的 6 个特异区域的引物，依赖与 Bst DNA 聚 合酶的强链置换活性，在 30~60 分钟内 DNA 扩增可达 109 ~1010 倍。该试剂盒配备变色反应指示剂，其含有羟基萘 酚蓝（HNB）指示染料，阳性扩增样品的颜色由紫罗兰色变 为天蓝色。 组分 名称 50T LAMP HNB Reagent 1 瓶 LAMP Buffer 0.75 ml 使用方法： 1. LAMP HNB Reagent 为干粉形式，包含 Bst4.0 DNA 聚 合酶、dNTP、HNB 显色剂等，在未溶解前，该制品可-20℃ 长期保存，并可室温运输，性能无下降。使用前每瓶用 0.75ml 的 LAMP Buffer 溶解后，可立即使用，剩余试剂可在-20℃ 保存 1 个月，在-60℃以下长期保存。 2. 按以下组分配置 LAMP 反应混合液 溶解后的 LAMP HNB Reagent 15 μl LAMP Primer Mix 1 or 1.5 or 2 μl 模板 DNA 1 μl ddH2O 到总体积 20 μl 首次实验时 LAMP Primer Mix 分别采用 1、1.5、2 μl，以 阴性不变色，阳性样品正常变色为标准，作为后续测试用 量。 3. 反应体系配好后，置于 60~65°C（首次实验采用 60°C）进行反应 20~45min（扩增良好的引物组合，通 常 25min 即可变色，一般不超过 45min，首次实验设置 20、25、30、45min）。 注意：在 LAMP 反应结束后禁止将反应管盖打开，否则可能 会导致气溶胶污染）。一旦发生气溶胶污染，请使用 的 DNA 气溶胶污染去除剂（A6001）进行环境清理。 LAMP 实验的条件优化 1. LAMP Primer Mix 浓度：FIP/BIP 分别为 16 μM、 LoopF/B 分别为 8 μM、F3/B3 分别为 2 μM。 2. 四个重要的参数，将对成功建立 LAMP 检测方法至关 重要，分别是：引物位置；引物使用浓度；反应温度；反 应时间。引物使用浓度、反应温度、反应时间是优先要确 认的参数，如经过参数调整后仍不能达到检测用标准，则 重新设计引物组合，再进行测试。

LAMP是一种新型核酸扩增技术，采用4或6条能够识别目的基因上的6个特异区域的引物，依赖于Bst DNA聚合酶的强链置换活性，在30~60分钟内DNA扩增可达109~1010倍。 LAMP检测方法分为多种，包括染料法、浊度法、电泳法以及我司最新开发的TaqMan荧光探针法。我司推出基于LAMP常用检测方法的冻干LAMP检测通用试剂盒，该系列产品为冻干制品，相对于市面上的液体型产品更加稳定，灵敏度更高，操作更加方便，通常在30min内完成检测。 LAMP变色扩增试剂盒包括：冻干LAMP-HNB变色扩增试剂盒、冻干LAMP橙绿变色扩增试剂盒、冻干LAMP浊度扩增试剂盒和冻干LAMP-TaqMan扩增试剂盒。其中 羟基萘酚蓝（HNB）是一种金属离子指示剂，HNB与镁离子结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色 ；而橙绿变色染料（OG Dye）则可与LAMP扩增产物结合成明显的肉眼可见的荧光绿色，阴性反应则为橙色；浊度法则是由浊度仪检测或肉眼观察LAMP剧烈反应产生的焦磷酸镁沉淀而判断反应结果;而LAMP-TaqMan则是由荧光检测仪器实时分析反应而判读结果。

LAMP方法比较

LAMP TaqMan LAMP-橙绿变色 LAMP-HNB LAMP-浊度 变色现象 荧光探针切割 橙色变绿色 紫罗兰色变天蓝色 无色变白色浑浊 检测设备 定量PCR仪或恒温荧光检测仪 肉眼可见 肉眼可见 肉眼可见或浊度仪 区分度 极易判读 极易判读 可以判读 相对不明显 灵敏度 单Copy 10Copy 10-50Copy 10-100拷贝 特异性 高特异 比较特异 一般 一般 反应温度 60~63℃ 60~65℃ 60~65℃ 60~65℃ 反应时间 15~25min 20~40min 20~40min 20~40min 反应用酶 Bst5.0 Bst4.0 Bst4.0 Bst4.0 综合推荐 ★★★★★ ★★★★★ ★★★ ★★ 试剂开发难度 较易 较难 非常难 较难

储存

所有制品为冻干形式，在未溶解前，该制品可-20℃长期保存，并可室温运输，性能无下降。使用LAMP Buffer溶解后，可立即使用，剩余试剂可在-20℃保存1个月，在-60℃以下长期保存。

实例

以检测非洲猪瘟病毒（ASFV）为例，以标准质粒为模板，分别用橙绿变色、HNB显色和浊度方法检测，结果如下图。

本公司免费为客户设计LAMP引物，需要设计引物者请来信咨询

注意事项

(1). 为了减少交叉污染，请分区操作（试剂和模板DNA的配置操作最好在不同区域中进行）。 (2). 实验时，所需模板量取决与样品类型（0.1 ng~100 ng），可先进行预实验确定模板量。 (3). 各区物品均为专用，不可交叉使用，防止污染。 (4). 实验过程中应穿工作服，带手套，建议使用带滤芯的一次性吸嘴。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！